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因?yàn)榻】刁w檢的需要，我們庫(kù)貝爾經(jīng)常用到全自動(dòng)生化分析儀，看醫(yī)生操作，看到自己的檢測(cè)結(jié)果，卻不知道全自動(dòng)生化分析儀到底怎么工作的?
一、基本結(jié)構(gòu)
(一)按照反應(yīng)裝置的結(jié)構(gòu)，自動(dòng)生化分析儀主要分為流動(dòng)式(Flow system)、分立式(Discrete system)兩大類。
1.流動(dòng)式指測(cè)定項(xiàng)目相同的各待測(cè)樣品與試劑混合后的化學(xué)反應(yīng)在同一管道流動(dòng)的過(guò)程中完成。這是第一代自動(dòng)生化分析儀。
2.分立式指各待測(cè)樣品與試劑混合后的化學(xué)反應(yīng)都是在各自的反應(yīng)杯中完成。其中有幾類分支。
(1)典型分立式自動(dòng)生化分析儀。此型儀器應(yīng)用最廣。
(2)離心式自動(dòng)生化分析儀，每個(gè)待測(cè)樣品都是在離心力的作用下，在各自的反應(yīng)槽內(nèi)與試劑混合，完成化學(xué)反應(yīng)并測(cè)定。由于混合，反應(yīng)和檢測(cè)幾乎同時(shí)完成，它的分析效率較高。
3.袋式自動(dòng)生化分析儀是以試劑袋來(lái)代替反應(yīng)杯和比色杯，每個(gè)待測(cè)樣品在各自的試劑袋內(nèi)反應(yīng)并測(cè)定。
4.固相試劑自定生化分析儀(亦稱干化學(xué)式自動(dòng)分析儀)是將試劑固相于膠片或?yàn)V紙片等載體上，每個(gè)待測(cè)樣品滴加在相應(yīng)試紙條上進(jìn)行反應(yīng)及測(cè)定。操作快捷、便于攜帶是它的優(yōu)點(diǎn)。
二、儀器一般工作流程
生化分析儀的正確應(yīng)用，只是掌握了測(cè)定技術(shù)原理還不夠，還需要對(duì)具體儀器的工作流程及測(cè)定計(jì)算方法有足夠的了解。
(一)一般工作流程
工作流程可以通過(guò)儀器的測(cè)定周期來(lái)考察。重點(diǎn)關(guān)注比色杯空白讀數(shù)點(diǎn)(CB)、加樣品點(diǎn)(S)、各試劑加液點(diǎn)(R1、R2、……)、試劑空白讀數(shù)點(diǎn)(RB)、各測(cè)定讀數(shù)點(diǎn)(P)、各點(diǎn)時(shí)間間隔及周期總時(shí)間等。每個(gè)儀器一般都在反應(yīng)轉(zhuǎn)盤(pán)的固定位置和反應(yīng)測(cè)定周期的固定時(shí)間設(shè)置樣品試劑和稀釋的加液位，以及測(cè)定讀數(shù)點(diǎn)。如HITACHI 7170在P1到P34周期為10分鐘時(shí)，PO前加樣品，Rl在Pl前，R2在P5和P6間，R3在P16和P17間，R4在：P33和P34間。
(二)數(shù)據(jù)處理計(jì)算方法
儀器在各個(gè)吸光度讀數(shù)點(diǎn)讀取的吸光度數(shù)據(jù)，并不一定都納人濃度計(jì)算。儀器往往根據(jù)儀器定義和操作者設(shè)定的要求，對(duì)吸光度原始數(shù)據(jù)作計(jì)算處理，轉(zhuǎn)換成所謂反應(yīng)數(shù)據(jù)，再按系數(shù)或公式作濃度計(jì)算。舉例如下：
1.HITACH 7170的終點(diǎn)法測(cè)定點(diǎn)(A )吸光度計(jì)算為(AX+AX-1)/2。實(shí)際吸光度=吸光度數(shù)據(jù)×10 000。
2.0LYHPUS AU 600試劑空白數(shù)據(jù)：P0點(diǎn)試劑空白(RB)=P0點(diǎn)吸光度一比色杯水空白(wB);任一測(cè)定點(diǎn)試劑空白(RB )。該點(diǎn)吸光度一比色杯水空白(WB)。
3.Monarch 1 000兩點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)數(shù)據(jù)。(終點(diǎn)測(cè)定吸光度一終點(diǎn)空白吸光度)一(始點(diǎn)測(cè)定吸光度一始點(diǎn)空白吸光度)。
4.AU 600的終點(diǎn)法(帶試劑空白，END法)的反應(yīng)數(shù)據(jù)=終點(diǎn)吸光度一P0點(diǎn)吸光度(試劑空白，RB)。終點(diǎn)法(不帶試劑空白，END).法)的反應(yīng)數(shù)據(jù)=終點(diǎn)吸光度-比色杯水空白(WB)。
5.Au 600的兩點(diǎn)法(自身空白)的反應(yīng)數(shù)據(jù)=[加第二試劑后測(cè)定點(diǎn)讀數(shù)一P0點(diǎn)讀數(shù)]一[加第二試劑前測(cè)定點(diǎn)讀數(shù)一PO點(diǎn)讀數(shù)]。
三、基本測(cè)定方法
(一)終點(diǎn)法(End pointmethod)
根據(jù)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其吸光度大小，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析的方法。對(duì)一般化學(xué)反應(yīng)來(lái)說(shuō)，反應(yīng)完全(或正、逆反應(yīng)動(dòng)態(tài)平衡)、反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定時(shí)為反應(yīng)終點(diǎn)。對(duì)抗原一抗體反應(yīng)來(lái)說(shuō)，是抗原和抗體完全反應(yīng)、形成最大且穩(wěn)定的免疫復(fù)合物時(shí)為終點(diǎn)。在反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線上為與x軸平行線區(qū)段。在測(cè)定計(jì)算方式上，一般分為一點(diǎn)法和兩點(diǎn)法兩種。
1.一點(diǎn)法(One Point)以試劑和樣品混合之前的空氣空白(GB)、水空白(WB)或試劑空白(RB)的吸光度值為測(cè)定計(jì)算基點(diǎn)，以反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，得到反應(yīng)吸光度。通過(guò)與相同條件下校準(zhǔn)液反應(yīng)吸光度的比較，求得測(cè)定結(jié)果。常與一點(diǎn)校準(zhǔn)法配合使用，即采用一個(gè)校準(zhǔn)濃度，校準(zhǔn)曲線通過(guò)零點(diǎn)且成線性。也應(yīng)用多點(diǎn)校準(zhǔn)。
2.兩點(diǎn)終點(diǎn)法(Two Point End)即終點(diǎn)一始點(diǎn)法以試劑和樣品混合之后的某一時(shí)間點(diǎn)作為始點(diǎn)，以反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度讀數(shù)減去始點(diǎn)讀數(shù)。一定條件下可降低樣品對(duì)反應(yīng)或反應(yīng)本身的特異性于擾(主要指色度干擾)。常采用雙試劑，多以加R2前某一點(diǎn)作測(cè)定始點(diǎn);某些情況下，也可以加R2后一點(diǎn)作測(cè)定始點(diǎn)。若使用單試劑，主反應(yīng)啟動(dòng)太快或儀器起始讀數(shù)點(diǎn)受限時(shí)難以運(yùn)用。
固定時(shí)間法(FixedMethod)與兩點(diǎn)終點(diǎn)法的區(qū)別只是在：測(cè)定讀數(shù)的末點(diǎn)不在反應(yīng)平衡區(qū)段，而是根據(jù)方法學(xué)選擇。如血清肌酐(苦味酸法)測(cè)定。
3.三點(diǎn)終點(diǎn)法即雙終點(diǎn)法，在一個(gè)通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項(xiàng)反應(yīng)相關(guān)的終點(diǎn)法測(cè)定。比如同測(cè)游離脂肪酸和甘油三酯。某些儀器(如HITACHI系列)設(shè)置此方法。
(二)連續(xù)監(jiān)測(cè)法(Continuousmonitoring method)
又稱速率法(RateAssay)。即連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程，根據(jù)所測(cè)定的產(chǎn)物生成或底物消耗的速度進(jìn)行定量分析的方法。在反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線上為反應(yīng)呈恒速區(qū)段(斜率保持不變)，常用于酶活性線性反應(yīng)期測(cè)定。
1.連續(xù)監(jiān)測(cè)法即零級(jí)反應(yīng)速率法，亦稱斜率法。在較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間區(qū)段內(nèi)(至少90-120秒)，每隔一定時(shí)間(常為2~30秒)讀取一次吸光度值，至少讀取4點(diǎn)，得到3個(gè)△A;一般將連續(xù)多次讀數(shù)作最小二乘法處理，讀數(shù)間隔時(shí)間太短的作帶速率時(shí)間(TR)多點(diǎn)法處理，均取線性反應(yīng)部分的讀數(shù)，求出單位時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速率△A/min。此法必須以零級(jí)反應(yīng)為測(cè)定計(jì)算的基礎(chǔ)，因?yàn)橹挥性诹慵?jí)反應(yīng)下，單位時(shí)間內(nèi)的吸光度變化(反應(yīng)速率△A/min)才與酶活力呈正比。此法相對(duì)減少了分析誤差，大大提高了分析速度和準(zhǔn)確性。但是，半自動(dòng)生化分析儀采用單樣品連續(xù)監(jiān)測(cè)，相當(dāng)耗時(shí)。應(yīng)用連續(xù)監(jiān)測(cè)法，首先應(yīng)準(zhǔn)備線性范圍內(nèi)的高、中、低濃度的樣品，分別作反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線，了解不同濃度下反應(yīng)全過(guò)程，兼顧確定延遲時(shí)間和線性監(jiān)測(cè)期。
2.兩點(diǎn)速率法即所謂擬一級(jí)速率法。在反應(yīng)中選取兩時(shí)問(wèn)點(diǎn)t 1、t 2，讀取吸光度A 1、A2，計(jì)算(A2-A1)，(t2-t1)=△A，△t。此方法與終點(diǎn)兩點(diǎn)法的區(qū)別主要有兩點(diǎn)：后一讀數(shù)點(diǎn)反應(yīng)未達(dá)終點(diǎn)，以速率計(jì)算結(jié)果。它與連續(xù)監(jiān)測(cè)法比較，缺點(diǎn)在于人為確定t 1、t 2，不定因素較多，不能保證反應(yīng)在t 1-t 2期間呈線性，影響結(jié)果準(zhǔn)確性;應(yīng)在常規(guī)測(cè)定前，先做預(yù)試驗(yàn)來(lái)確定線性時(shí)間段。若在選擇的時(shí)間段內(nèi)反應(yīng)不成線性(如零級(jí)反應(yīng)期短，儀器無(wú)法設(shè)置或測(cè)定)，則只能改用終點(diǎn)法。優(yōu)點(diǎn)在于方法簡(jiǎn)單;酶活力較低、測(cè)定吸光度值較小時(shí)，可增加測(cè)定時(shí)間段而不受儀器連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)的局限，減少讀數(shù)誤差。
3.速率B法在一個(gè)通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項(xiàng)反應(yīng)相關(guān)的速率法測(cè)定。它既可以是兩項(xiàng)試驗(yàn)測(cè)定，也可用于干擾或/及樣品空白自動(dòng)補(bǔ)償0后一用途的原理是：利用儀器的微機(jī)自動(dòng)處理，在第一反應(yīng)(干擾反應(yīng))一直維持線性的前提下，可以從第二反應(yīng)(主反應(yīng))速率中扣除第一反應(yīng)速率的延續(xù)影響。如用于消除膽紅素轉(zhuǎn)化為膽綠素吸光度下降、對(duì)肌酐苦味酸法測(cè)定的負(fù)干擾等。某些儀器(如HITACHI系列)設(shè)置此方法。
(三)空白(blank)校正
在分光光度法中，常利用空白溶液來(lái)調(diào)節(jié)儀器的吸光度零點(diǎn)，或用來(lái)抵消某些測(cè)定的干擾因素。在生化分析儀測(cè)定中，除了采用雙或多波長(zhǎng)、兩點(diǎn)法等排除背景干擾外，常要運(yùn)用專門(mén)空白測(cè)定，以便從樣品測(cè)定吸光度中扣除其影響。正確選擇空白校正，對(duì)提高準(zhǔn)確度起重要作用。
1.試劑空白一般在方法類型和校準(zhǔn)模式中，即分為有或無(wú)試劑空白兩大類。試劑空白單獨(dú)測(cè)定或與校準(zhǔn)配合測(cè)定，并需預(yù)選裝載去離子水樣品杯或試劑空白架。校準(zhǔn)或病人樣品的各測(cè)定點(diǎn)吸光度，均要扣除相應(yīng)測(cè)定點(diǎn)的試劑空白吸光度或空白速率值。無(wú)試劑空白的方法，多直接以反應(yīng)杯的水空白作為測(cè)定基準(zhǔn)值。
2.樣品空白主要為了消除樣品本身混濁或色度的干擾。常采用空白通道法，測(cè)定校正結(jié)果=顯色反應(yīng)通道結(jié)果-空白通道結(jié)果。多數(shù)儀器須另外占用測(cè)定通道，分析速度減半，但去干擾的準(zhǔn)確性應(yīng)高于兩點(diǎn)終點(diǎn)。 |
